شناسائی و تعیین دامنه میزبانی عامل فیتوفترائی پوسیدگی ریشه وطوقه گوجه فرنگی با استفاده از روش های ملکولی ومرفولوژیکی در استان فارس

شناسائی وتعیین دامنه میزبانی عامل فیتوفترائی پوسیدگی ریشه وطوقه گوجه فرنگی با استفاده از روشهای ملکولی ومرفولوژیکی در استان فارس از گیاهان گوجه فرنگی (lycopersion esculentum mill) در استان فارس که دارای پوسیدگی و نکروز وسیع روی ریشه و طوقه ، و در قسمت‏های هوائی علائم زردی و پژمردگی داشتند به طور مکرر یک گونه فیتوفترای هتروتالیک از ریشه اصلی روی محیط کشت اختصاصی parp)) جداسازی گردید. بااستفاده از ترکیبی از معیارهای ریخت شناسی ، بیماری زایی وخصوصیات رشد هفت جدایه فیتو فترا از گوجه فرنگی جدا شده در مرودشت استان فارس به شرح ذیل مورد بررسی وشناسایی قرارگرفت . قطر اا وسپور روی محیط کشت (pda) بین 2/37-5/21 میکرومتر متغیر بود. آنتریدیوم عمدتاً آمفیژن بودند. اسپورانژیم ها در عصاره خاک سترون تشکیل گردید .اسپورانژیم ها پاپیل دار ،ریزان ، تخم مرغی تا گرد، به اندازه 37-22 × 41-53 میکرومتر و نسبت طول به عرض بین 6/1 -2/1 متغیر بود.درجه حرارت کمینه ، بهینه و پیشینه جهت رشد شعاعی کلنی ها روی محیط pda بترتیب 10 ،5/25 و 35 درجه سانتیگراد بود. بر اساس خصوصیات مورفولوژیکی و محیطی، جدایی های فیتوفترا بدست آمده از گوجه فرنگی با مشخصات گونه phytophthora capsici leoin مطابقت داشتند . استفاده از مشخصات ریخت شناسی وخصوصیات فیزیولوژیکی به دلیل تعداد محدود صفات افتراقی و وجود سطح بالایی از تکامل همگرا در این صفات، همچنین زمان بر و تغییر پذیر بودن آنها منجر به ایجاد مشکلاتی در شناسائی دقیق این گروه از بیمارگرهای گیاهی شده است. لذا در این مطالعه دو روش ملکولی جهت تایید تشخیص به روش مرفولوژیکی مورد استفاده قرارگرفت. اولین روش، استفاده از الگوی چند شکلی قطعات حاصل از برش با آنزیم‏های برشی (rflp) ناحیه its بوده که، دی ان ای هفت جدایه فیتوفترا جمع آوری شده و دو جدایه استاندارد پس از کشت در محیط pdb به مدت یک هفته با استفاده از کیت استخراج گردید. نواحی توالی های its با استفاده از آغازگرهای عمومی its4 و its5 تکثیر گردید. این آغازگرها قطعه ای به اندازه تقریبی 900 جفت باز را در جدایه‏ها تکثیر نمودند. قطعه تکثیر شده تحت تاثیر آنزیم‏هایi rsa،haeiii وi hpai قرار گرفت. محصول هضم در ژل آگارز 2 % الکتروفورز و پس از رنگ آمیزی با اتیدیم بروماید الگوی چند شکلی طول قطعات حاصل اثر آنزیم‏های برشی بررسی و با الگوی دو جدایه قارچ مذکور مقایسه شد. نتایج نشان داد که الگوی چند شکلی ناحیه its هفت جدایه جمع آوری شده از شهرستان مرودشت شامل ph2 ، ph5،ph7 ، ph8،ph9 ،ph10 و ph11 با دو جدایه استاندارد با آنزیم i rsa کاملا مشابه یکدیگر بودند. دومین روش استفاده شده در این پژوهش تعیین توالی منطقه its4-5 rdna یکی از جدایه‏های بدست آمده با استفاده از آغازگرهای اختصاصی مبتنی بر توالی‏های جداکننده نسخه برداری شده‏ی داخلی مربوط به دی ان ای ریبوزومی (rdna)بود. برای اطمینان از تشخیص صحیح، توالی‏های its دی ان ای ریبوزومی فزون سازی، خالص سازی، توالی سنجی و ویرایش شده، پس از آزمون‏های فیلوژنتیکی در بانک ژن وارد گردید. و درخت فیلوژنتیکی آن ترسیم شد. نمونه های جداسازی شده از گوحه فرنگی در استان فارس دارای 100-99% مشابه با کلیه توالی ph. capsici موجود در بانک ژن بودند وگونه شناسایی شده با استفاده از این روش تأیید گردید. بر اساس نتایج ریخت شناسی و الگوی rflp وتعیین توالی منطقه its4-5rdna عامل پوسیدگی ریشه و طوقه گوجه‏ فرنگی در استان فارس ph. capsici تشخیص داده شد ، لذا استفاده از روش های مولکولی مبتنی بر زنجیره پلی مراز تکمیل کننده روشهای مورفولوژیکی در شناسایی گونه های phytophthora محسوب می شوند. بررسی ها در این تحقیق نشان داد که دامنه میزبانی ph. capsici محدود به گوجه فرنگی نمی‏باشد و انواع گیاهان جالیزی یکساله مثل کدو، خیار، طالبی، هندوانه، خربزه, نخود نیز جزء دامنه میزبانی این بیمارگر محسوب می‏شوند. نتایج مایه زنی بر روی این گیاهان برای کلیه جدایه‏ ها مثبت بود و باعث لهیدگی و پوسیدگی و زردی این گیاهان گردید. این اولین گزارش از شناسایی ph. capsiciبه عنوان عامل پوسیدگی ریشه وطوقه گوجه فرنگی با استفاده از روش ملکولی دراستان فارس و کشور می باشد.